純溶媒中では強いペプチドの信号が、ペプチドの実際の質量は減っていなくても、血漿中では弱くなることがあります。同時に溶出するマトリックス成分がエレクトロスプレーの応答を変えるためです。そのため、純溶液だけで調製した検量用試料は、生体試料中の応答を正しく表さない場合があります。候補となる代替ペプチドを実際に使用するマトリックスで試し、信号の強さだけでなく、検証した分析性能に基づいて定量用ペプチドを選ぶ必要があります。
リツキシマブ分析で実測された例
ヒト血漿中のリツキシマブについてLC–MS/HRMS法とLC–MS/MS法を比較した研究では、タンパク質の処理と消化の後に代替ペプチドを得ました。論文の表7には、複数の候補ペプチドのマトリックス効果が示されています。HRMS法では、 6つの異なる血漿由来試料 に 50 µg/mLのリツキシマブを添加しました。イオン抑制の程度は大きく異なり、FSGSの平均は−67%（範囲−54%～−78%）、pQVQは−11%（報告範囲+15%～−35%）、pQIVLは−93%（範囲−88%～−95%）でした。pQIVLは両MS法でマトリックス効果が大きかったため、著者らは定性的な確認用にのみ使用しました。[1、§2.3.3、表7]
| HRMSの代替ペプチド | 報告された平均マトリックス効果 | 試験条件 |
|---|---|---|
| FSGS | −67% | ヒト血漿6試料、リツキシマブ50 µg/mLを添加 |
| pQVQ | −11% | 同じ研究のHRMS条件 |
| pQIVL | −93% | 同じ研究のHRMS条件。定性的確認に使用 |
LC–MS/MS法では、 4つの血漿由来試料, で急上昇し、 15および300 µg/mLを添加しました。表7によると、平均抑制率はpQVQで−17%、pQIVLで−22%でした。装置、血漿試料数、添加濃度が異なるため、これらの値をHRMS法の値と合算して一般的な「ペプチドのマトリックス効果」として扱うことはできません。[1]
実務的な評価の組み立て方
タンパク質の配列が許す場合は、複数の候補ペプチドを選択してください。各候補の同定と分離を確認した後、原液、抽出後のマトリックス、および完全に処理されたマトリックスにおける応答を比較してください。原液と抽出後の応答の対比は、イオン化の影響を特定するのに役立ちます。また、抽出後の応答と処理後の応答の対比は、調製過程での損失を明らかにすることができます。 複数の独立したマトリックスロットと、アッセイで測定する必要がある濃度範囲を確認してください。適切な同位体標識標準物質が利用可能な場合は、内部標準で正規化されたマトリックス係数を追跡してください。本論文では、フルレングスの標識リツキシマブを内部標準として使用しました。これは、消化後にのみ添加されるペプチドよりも多くの調製工程を経ることができます。 標準物質の添加タイミングは、アッセイが補正すると主張している内容と一致していなければならない。.
マトリックス効果は 分析対象と方法に固有です。抑制が小さいペプチドでも、選択性、検量、精度、消化挙動が許容範囲にあることを確認しなければなりません。強く抑制される候補でも、同一性を確かめる信頼性が保たれていれば、報告されたpQIVLのように定性的確認に使える場合があります。ただし、単独の定量用ペプチドとして適切とは限りません。同じ論文には検証済みの2法の検量と精度も報告されていますが、別の抗体や装置への適用を証明するものではありません。[1、§§2.3.2–2.3.3]
代替ペプチドの選択記録
候補ごとに次を記録します。（a）配列の固有性と裏づけとなるフラグメントイオン、（b）消化収率と未切断の形、（c）低濃度・高濃度における独立したマトリックスロット間のマトリックス因子の分布、（d）妨害成分との保持時間上の分離、（e）内標準で正規化した後の性能です。採用しなかった候補とその理由も残します。純溶媒中で見かけ上高い応答が得られても、これらの確認の代わりにはなりません。
その ICH M10ガイドライン は、マトリックス成分による分析対象の応答変化をマトリックス効果と定義しています。規制用途の生物分析法バリデーションでは、低・高のQC濃度について 少なくとも6つ マトリックスの供給源／ロット数。ただし、希少なマトリックスについては、適切な柔軟性が認められる。これは重要な設計上の基準であり、すべての探索的研究アッセイに自動的に求められる要件ではない。本論文のHRMS実験では6種類の血漿が使用された一方、MS/MS実験では4種類が使用された。[2、§§1.3および3.2.3]
解釈の範囲と次の手順
測定値は ヒト血漿中のリツキシマブ由来の代替ペプチド, 、遊離のペプチド標準物質やNHD製品ではありません。これらは、ある配列の分析応答を別の配列から推測できない理由を示しています。特定のペプチドの正確な質量や断片化の解釈には、 LC–MSによる同定ガイドを参照してください。 面積純度と含量のガイドは、クロマトグラムの面積と含量の意味の違いを扱います。どちらもマトリックスに合わせたバリデーションの代わりにはなりません。
一次資料と記述の根拠
- Development, Validation, and Comparison of Two Mass Spectrometry Methods (LC-MS/HRMS and LC-MS/MS) for the Quantification of Rituximab in Human Plasma. 分子. 2021;26:1383. DOI 10.3390/molecules26051383, PMID 33806585。 所在地： §2.3.3と表7（血漿試料数、添加濃度、ペプチド別のマトリックス効果、pQIVLの使用判断）、§2.3.2（検量条件）、Methods（全長の安定同位体標識リツキシマブ）。表の値は原著全文のXMLと照合済みです。
- International Council for Harmonisation. ICH M10: Bioanalytical Method Validation and Study Sample Analysis、最終ガイドライン、2022年。 所在地： §§1.3 および 3.2.3；規制の適用範囲および独立マトリックス・ロット設計。これは権威ある方法指針であり、本試験で測定された抑制値を示す証拠ではない。.
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一次記録と信頼できる情報源
- Development, Validation, and Comparison of Two Mass Spectrometry Methods (LC-MS/HRMS and LC-MS/MS) for the Quantification of Rituximab in Human Plasma出典1. §2.3.3および表7（血漿中のソースカウント、スパイク濃度、ペプチド特異的なマトリックス効果、およびpQIVL判定基準）；§2.3.2（校正の背景）；「方法」（全長安定同位体リツキシマブ）。表の値は確認済み
- 国際調和会議（ICH）。ICH M10：生物分析法のバリデーションおよび試験試料の分析、最終ガイドライン、2022年。該当箇所：§§1.3および3.2.3；規制上の適用範囲および独立したマトリックス・ロット設計。これは出典 2. §§1.3 および 3.2.3；規制の適用範囲および独立マトリックス・ロット設計。これは権威ある試験方法のガイダンスであり、当該試験で測定された抑制値を示す証拠ではない。.
