ペプチドマッピングには再現性のあるタンパク質消化が必要です。切断されなかった部位があると、同じ修飾の信号が複数のペプチド形態に分散し、相対定量や分析間の比較が難しくなります。ただし、消化時間は長ければよいわけではありません。試料調製中の修飾が増えたり、消化が進んだ結果、それまで検出しにくい配列領域を覆っていた長いペプチドが消えたりします。
実測データによる比較
Kristensenらは、モノクローナル抗体のLC–MS多属性分析に用いるトリプシン消化を、最適化した 自動2段階法 、元の 自動1段階法 、従来法の3条件で比較しました。対象は参照プロジェクトと社内プロジェクトの8種類の抗体試料です。2段階法では、論文に記載された緩衝液と酵素の条件下で、 75 °Cで15分、その後40 °Cで30分 著者らが指定したバッファーおよび酵素の条件下で。[1、実験セクション]
同定結果における ミスドクリベージのないペプチドの平均割合 だった 60% 、1段階法で 32% 、従来法で 34% 従来のプロトコルについては、これらは本研究のデータセットにおいて同定されたペプチドに占める割合であり、抗体分子が完全に消化された割合ではない。また、本論文では、2段階ワークフローにおけるMS/MS配列カバレッジがわずかに低いことも報告されている。著者らは、その原因を、より長い「ミスド・クリーベーション」ペプチドが失われたことにあると指摘し、重要な領域については精査が必要であると注意を促している。 [1、結果、図3～4および表S5]
| この抗体研究の方法 | 同定ペプチドのうちミスドクリベージなしの平均割合 | 解釈 |
|---|---|---|
| 最適化した自動2段階トリプシン消化 | 60% | ミスドクリベージが少ない一方、失われる配列領域を確認する。 |
| 元の自動1段階消化 | 32% | 少なくとも1か所のミスドクリベージを含む同定ペプチドが多い。 |
| 従来のMAM消化 | 34% | この比較では1段階法と近い割合。 |
実際のペプチドマップで確認する項目
まず切断規則を明示し、ミスドクリベージを含む形態を総数だけでなく配列ごとに数えます。重要なペプチドについて、完全に切断された形態と長い未切断形態の抽出イオンクロマトグラムを、修飾状態も含めて比較します。機能や品質に関係する領域の配列カバレッジを確認してください。全体の改善が局所的な欠落を隠す場合があります。消化時間・温度、pH、還元、酵素活性、反応停止のタイミングを一体の手順として評価します。経時傾向を追う方法なら、対象となるペプチド形態の許容基準と、日・分析者をまたぐ再現性を示します。
同じ論文では、疎水性ペプチドに対するC4とC18の逆相カラムも別に評価しています。USP mAb3の比較で、ペプチドH44–65が次のブランクに残った割合は、 Accucore C4で 0.21%、Accucore C18で 12.06%. この結果は、困難なマッピングには、消化の問題とクロマトグラフィーの問題の両方が含まれている可能性があることを示している。ただし、これはすべてのC4カラムがすべてのC18カラムよりも優れた性能を発揮するという意味ではない。本論文におけるHypersilを用いた比較は異なる条件で行われており、配列カバレッジについては依然として確認が必要である。[1、表1]
別のNISTmAbペプチドマッピング最適化研究では、トリプシンの由来を比較し、ミスドクリベージ、非特異的切断、自己消化、同定ペプチドの総信号強度を合わせて評価しました。この実験では組換えブタ由来候補のミスドクリベージが他の2種類より 3パーセントポイント低い 結果でしたが、全基準で明確に優れた候補はありませんでした。消化条件は、全体を表す一つの割合だけで選ぶべきではありません。[2、Figure 6]
マップ比較に最低限残す記録
消化法を比較する際は、同じ出発材料と同じLC–MS測定順序を用います。切断形態の分布を ペプチドによるに保存し、全体および重要領域の配列カバレッジ、修飾率、自己消化・バックグラウンドピーク、ブランクへのキャリーオーバーも記録します。ミスドクリベージなしの割合が改善しても、必要な領域が検出されなくなるなら、新手順の採用前に追加検討が必要です。
エビデンスの適用範囲と次の手順
これらは 抗体をトリプシン消化したペプチドマップの結果であり、未消化のカタログペプチドやNHDの製造ロットの結果ではありません。研究を参考に自施設で比較し、 LC–MSによるペプチド同定ガイド また、マップの配列カバレッジおよび修飾の割り当てを記録する。ピーク数だけでは、完全な構造的証拠とはならない。.
一次資料と記述の根拠
- Kristensen DB, et al. Optimized Multi-Attribute Method Workflow Addressing Missed Cleavages and Chromatographic Tailing/Carry-Over of Hydrophobic Peptides. Analytical Chemistry. 2022;94:17195–17204. DOI 10.1021/acs.analchem.2c03820, PMID 36346901。 所在地： Experimental Sectionの「Optimized Two-Step SMART Digestion Protocol」（時間と温度）、Resultsの「Optimized Two-Step SMART Digest Protocol」、Figures 3–4とTable S5（60/32/34%と配列カバレッジの注意点）、Table 1（C4/C18とH44–65のキャリーオーバー）。一次資料全文を確認。
- Mouchahoir T, Schiel JE. Development of an LC-MS/MS peptide mapping protocol for the NISTmAb. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2018. 場所： Results、Figure 6と関連する考察（トリプシン由来の比較と3パーセントポイントの差）。独立した一次研究であり、[1]と結果を統合していない。
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一次記録と信頼できる情報源
- Kristensen DB ほか. 疎水性ペプチドの切断漏れおよびクロマトグラフィーにおけるテーリング／キャリーオーバーに対処するための、最適化された多属性法ワークフロー. Analytical Chemistry. 2022;94:17195–17204.出典 1. 実験の項 → 「最適化された 2 段階 SMART 消化プロトコル」（時間／温度）； 結果 → 「最適化された2段階SMART消化プロトコル」、図3～4および表S5（60/32/34%およびカバレッジに関する注意点）；表1（C4/C18 H44
- Mouchahoir T、Schiel JE. NISTmAb 用の LC-MS/MS ペプチドマッピングプロトコルの開発。『Analytical and Bioanalytical Chemistry』. 2018. 掲載箇所：結果、図 6 およびその考察（トリプシン源の比較および……）出典 2. 結果、図 6 およびその考察（トリプシン源の比較および 3 パーセントポイントの未切断差）。独立した一次手法に関する研究であり、[1] と統合されていない。.
