ペプチド標準品の注入後に測定したブランクに目的成分のピークが現れても、ブランクに新たな生物学的シグナルが存在する証拠にはなりません。前の注入に由来する物質がオートサンプラー、流路、カラムに残っている可能性があります。キャリーオーバーの調査では、 残留シグナルの発生箇所 また、その分析の実際の注入順序において、その後のブランクにどれだけの量が残っているか。.
ニューロペプチド Y の実験で測定したこと
公表された検討では、研究者らは 1 µMのニューロペプチド Y（NPY）溶液を1 µL 、LC–Orbitrap システムに注入し、その後のブランクに現れる NPY ピークを測定しました。キャリーオーバー率は、ブランクのピーク強度を直前の NPY 試料のピーク強度で割った値と定義しています。最初のブランクの値は、直前の1 µM試料の 4.05% でした。同じ論文は、5 µMおよび10 µMのNPY標準品について、それぞれ 0.36% そして 0.47% を報告しています。高濃度の注入後に比率が小さくても、残留した絶対量が少ないとは限りません。分母が変わっているためです。[1、Results and Discussion、Table 1]
| NPY標準品、注入量1 µL | 最初のブランクのキャリーオーバー率 | 解釈上の注意 |
|---|---|---|
| 1 µM | 4.05% | その前の規格の信号に対する比率 |
| 5 µM | 0.36% | 分母が異なり、残留絶対量も異なる可能性がある |
| 10 µM | 0.47% | この分析法での比率であり、一般的な許容限度ではない |
研究者らは続いて流路の構成要素を一つずつ変えました。ブランクが試料ニードルを通らない条件では、1 µMに対する推定キャリーオーバー率が 4.05%から3.05%. 。カラムを除外したり、ニードルおよび高圧バルブのシールを交換したりして行ったさらなる比較の結果、複数の表面が関与していることが示唆された。シールの交換とガードカラムの除去を含む、本論文で最適化された構成において、最初のブランクは 2.15% 、後続のブランクは 0.9%でした。2.15% という結果をシール交換だけの効果とみなすことはできません。これらの操作はその装置の発生箇所を絞るためのものであり、あらゆる LC–MS 装置に適用できる洗浄手順ではありません。[1、「Strategy for identifying carry-over sites」、Experiments 1–3、Table 4]
条件を管理した原因調査
定義された高基準値に基づいてブランク分析を行い、対象物質の保持時間、質量／遷移、および信号を記録する。信号が減衰するかどうかを確認するために、十分な回数のブランク分析を繰り返すこと。1回のブランク分析で信号が消去されるとは仮定してはならない。機器の仕様が許す場合は、通常の試料経路を経由せずに注入したブランクを分析し、イオン源または溶媒由来のバックグラウンドをLC経路からのバックグラウンドと分離する。変更 一度に変更するのは一つの部品または洗浄条件だけにします。対象はニードル流路、バルブやシール、配管、ガードカラム、分析カラムです。比較ごとに注入質量、ブランクを測るタイミング、グラジエント、積分規則を同じにして記録します。
キャリーオーバーと表面吸着は関連しているものの、それぞれが示す現象は異なります。吸着により、現在の試料の信号が低下する可能性があります。その後、脱着が起こると、次のブランク試料の信号が上昇する可能性があります。 ブランクは調製中に汚染される可能性もあるため、独立して調製した溶媒ブランクおよびマトリックスブランクを含めること。定量下限および想定される試料順序に基づいて、分析法固有の合格基準を定義すること。本論文で提示されている「1%」目標値を普遍的な仕様として採用してはならない。 LC–MSによる同定ガイド は、同定の根拠と偶然一致したピークとの違いを説明しています。
比較する分母を確認する
NPYに関する論文の割合は、以下のものを用いて算出されています 直前の試料ピーク を分母とします。一方、規制対象の生物分析法バリデーションでは、 ICH M10 は最高濃度の検量線試料の後にブランクを測定し、その分析対象物応答を 定量下限（LLOQ）での応答 （および内部標準の応答を別途）。これらは異なる試験であり、LLOQの信号がない状態では、2%のブランク対高濃度標準物質の比をM10の閾値に基づいて判断することはできません。 M10の公表されている閾値は、LLOQにおける分析物の応答が20%、その状況下での内部標準の応答が5%である。これらは、規制対象外の研究における普遍的な目標値ではない。[2, §3.2.6]
分析ランを受け入れる前に、高濃度試料の前のブランク、高濃度試料、最初のブランク、後続のブランク、次の低濃度試料という順序を保存します。検証済みのLLOQがある場合は、ブランク/高濃度試料とブランク/LLOQの両方の比率を記録します。小さく見える百分率が低濃度域での大きな偏りを隠さないようにするためです。
エビデンスの適用範囲
これは 一つのNPY用LC–MSシステムです。NHDの製造ロットを試験したものではなく、すべてのペプチドの一般的な性能も示していません。参考になるのは、発生源を切り分け、ブランクの注入順序を繰り返し、各操作の効果を確かめる実験の組み立て方です。導入前に、各施設は使用する洗浄溶媒がカラム、シール、質量分析計のイオン源に適合することを確認する必要があります。
一次資料と記述の根拠
- Troubleshooting Carry-Over in the LC-MS Analysis of Biomolecules: The Case of Neuropeptide Y. Mass Spectrometry. 2020. DOI 10.5702/massspectrometry.S0083, PMID 33299733。 所在地： Results and Discussion/Table 1（1 µL、1/5/10 µM、比率の定義と4.05/0.36/0.47%）；「Strategy for identifying carry-over sites」のExperiments 1–3（ニードルとカラムの経路を切り分けた比較）；Table 4（シール交換後のブランク）。原著全文を確認。
- International Council for Harmonisation. ICH M10: Bioanalytical Method Validation and Study Sample Analysis、最終ガイドライン、2022年。 場所： §3.2.6（キャリーオーバーの定義、ULOQ後のブランク、LLOQと内標準の比較対象）。NPY実験の再解釈ではなく、規制上の比較としてのみ使用。
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一次記録と信頼できる情報源
- Troubleshooting Carry-Over in the LC-MS Analysis of Biomolecules: The Case of Neuropeptide Y出典 1. 結果と考察／表 1（1 µL、1/5/10 µM、比率の定義および 4.05/0.36/0.47%）； 「キャリーオーバー部位の特定手法」、実験1～3（針およびカラムの分離）；表4（シール交換後のブランク）。.
- 国際調和会議（ICH）。ICH M10：生物分析法のバリデーションおよび試験試料の分析、最終ガイドライン、2022年。参照箇所：§3.2.6（キャリーオーバーの定義、ULOQ、LLOQ、および内部標準の定義の後に空白）出典 2. §3.2.6（繰越の定義、ULOQ、LLOQ、および内部標準の分母の後に空白がある）。規制上の比較対象としてのみ使用され、NPY実験を再解釈するためのものではない。.
