多肽在纯溶剂中信号很强，在血浆中却可能明显减弱，即使多肽的实际质量没有减少也会如此。与分析物一同洗脱的基质成分会改变电喷雾响应。因此，只用纯溶液配制的校准品，可能无法代表生物样品中的仪器响应。实际选择应是：在目标基质中测试候选替代肽，依据经验证的方法表现选择定量肽，而非只看信号强弱。
利妥昔单抗分析中的实测例子
一项比较人血浆中利妥昔单抗 LC–MS/HRMS 与 LC–MS/MS 方法的研究，在蛋白处理和酶解后生成替代肽。论文表 7 报告了多种候选肽的基质效应。在 HRMS 方法中，研究者使用 六份不同来源的血浆 ，加入 50 µg/mL 利妥昔单抗。离子抑制差异显著：FSGS 平均为 −67%（范围 −54% 至 −78%），pQVQ 平均为 −11%（报告范围 +15% 至 −35%），pQIVL 平均为 −93%（范围 −88% 至 −95%）。由于 pQIVL 在两种 MS 方法中都表现出较大的基质效应，作者仅将它用作定性确认肽。[1，§2.3.3、表 7]
| HRMS 替代肽 | 报告的平均基质效应 | 测试条件 |
|---|---|---|
| FSGS | −67% | 六份人血浆；加入 50 µg/mL 利妥昔单抗 |
| pQVQ | −11% | 同一研究的 HRMS 条件 |
| pQIVL | −93% | 同一研究的 HRMS 条件；用作定性确认肽 |
LC–MS/MS 部分使用的是 四份血浆, 峰值出现在 15 和 300 µg/mL利妥昔单抗。表 7 报告 pQVQ 的平均抑制为 −17%，pQIVL 为 −22%。不能把这组数值与 HRMS 数值合并成一个笼统的“多肽基质效应”：仪器、血浆来源数量和加标水平都不同。[1]
如何设计实际评估
在蛋白质序列允许的情况下，选择多个候选肽。确认每个候选肽的身份和分离情况，然后比较其纯溶液、萃取后基质和完全处理后基质中的响应。纯溶液与萃取后响应之间的对比有助于识别电离效应；萃取后响应与处理后响应之间的对比可揭示制备过程中的损失。 检查多个独立的基质批次，并验证该检测法必须测定的浓度范围。如果有合适的同位素标记标准品，请追踪经内标归一化的基质因子。本文使用全长标记的利妥昔单抗作为内标，其可经受的制备步骤比仅在消化后添加的肽更多。 标准物质的添加时机必须与该检测方法所宣称的校正对象相匹配。.
基质效应 取决于具体分析物和方法。抑制较小的肽仍须满足选择性、校准、精密度和酶解行为方面的要求。抑制较强的候选肽如果仍能可靠地确认身份，有时可像论文中的 pQIVL 一样用作定性确认肽；但这不意味着它适合单独承担定量。该论文还报告了两种验证方法的校准和精密度结果，但这些结果不能证明方法可直接用于另一种抗体或仪器。[1，§§2.3.2–2.3.3]
替代肽选择记录
对每种候选肽，记录：（a）序列特异性和碎片离子证据；（b）酶解产率和漏切形式；（c）低、高浓度下，不同独立基质批次的基质因子分布；（d）保留时间与干扰物的分离情况；（e）内标归一化后的表现。也要保留被淘汰的候选肽及淘汰理由。纯溶剂中的高信号不能代替这些检查。
该 ICH M10 指南 将基质效应独立定义为：基质成分导致分析物响应发生变化。在法规用途的生物分析方法验证中，指南要求在低、高质量控制水平，使用 至少六份 矩阵来源/批次，并对罕见矩阵给予合理的灵活性。这是一项相关的设计基准，而非针对每项探索性研究检测的强制性要求；该论文中的HRMS实验也使用了六份血浆样本，而其MS/MS实验组则使用了四份。[2，第1.3节和第3.2.3节]
适用边界与下一步
上述实测值来自 人血浆中的利妥昔单抗替代肽, ，而非游离肽标准品或NHD产品。这些例子说明了为何不能根据另一条序列来推断某条序列的分析响应。若要解释特定肽的确切质量和碎裂情况，请使用 LC–MS 鉴定指南；理解色谱峰面积与含量的区别时，可参考 纯度与含量指南。两篇指南都不能替代与基质相匹配的方法验证。
原始资料与主张溯源
- Development, Validation, and Comparison of Two Mass Spectrometry Methods (LC-MS/HRMS and LC-MS/MS) for the Quantification of Rituximab in Human Plasma. 分子. 2021;26:1383. DOI 10.3390/molecules26051383, PMID 33806585。 地点： §2.3.3 和表 7（血浆来源数量、加标水平、各肽的基质效应以及 pQIVL 用作定性确认肽的决定）；§2.3.2（校准条件）；Methods（全长稳定同位素标记利妥昔单抗）。表格数值已对照原始全文 XML。
- International Council for Harmonisation. ICH M10: Bioanalytical Method Validation and Study Sample Analysis，最终版指南，2022。 地点： §§1.3 和 3.2.3；监管范围和独立矩阵-批次设计。这是权威的方法指南，并非该研究中测得的抑制值的证据。.
如何解读这篇文章
本文汇总了第三方记录，并不对任何目录批次的身份、质量、安全性或有效性作出任何认定。.
研究用途边界： 本网站讨论的目录材料仅供实验室研究、开发和制造使用，不适用于人类或兽医用途。此内容不是医疗建议，也不提供给药说明。
主要记录和权威来源
- Development, Validation, and Comparison of Two Mass Spectrometry Methods (LC-MS/HRMS and LC-MS/MS) for the Quantification of Rituximab in Human Plasma来源 1. §2.3.3 和表 7（血浆样本计数、加标浓度、肽特异性基质效应以及 pQIVL 合格判定）；§2.3.2（校准背景）；方法（全长稳定同位素利妥昔单抗）。已核对表格中的数值
- 国际协调理事会。ICH M10：《生物分析方法验证与研究样品分析》，最终指南，2022年。相关章节：第1.3节和第3.2.3节；监管范围和独立基质-批次设计。这是来源 2. 第 1.3 节和第 3.2.3 节；监管范围和独立矩阵批次设计。这是一份权威的方法指南，并非该研究中测得的抑制值的证据。.
