肽图分析依赖可重复的蛋白酶解。一次漏切可能使同一修饰信号分散在多种肽段形式中，增加相对定量和批次间比较的难度。但酶解时间并非越长越好：过长的样品处理可能增加制备过程中产生的修饰；更充分的切割也可能使原本覆盖难检序列区域的较长肽段消失。
一项实测比较
Kristensen及同事比较了用于单克隆抗体LC-MS多属性分析的三种胰蛋白酶酶解流程：优化的两步自动化方案、原有的一步自动化方案和常规方案。研究纳入八种抗体样品。在作者规定的缓冲液和酶条件下，两步方案先在75°C下进行15分钟，再在40°C下进行30分钟。[1，实验部分]
两步方案中，已鉴定肽段没有漏切的平均占比为60%；一步方案为32%，常规方案为34%。这些数字指研究中已鉴定肽段的占比，不是被完全酶解的抗体分子占比。两步方案的MS/MS序列覆盖率略低。作者认为，这与较长的漏切肽段减少有关，因此仍需检查关键区域是否被覆盖。[1，结果、图3–4及表S5]
| 该抗体研究中的流程 | 已鉴定肽段中零漏切者的平均占比 | 主要解读 |
|---|---|---|
| 优化的两步自动化胰蛋白酶酶解 | 60% | 漏切形式减少；仍须检查是否失去序列覆盖。 |
| 原有的一步自动化酶解 | 32% | 更多已鉴定肽段至少有一次漏切。 |
| 常规 MAM 酶解 | 34% | 在本研究中，零漏切比例接近一步方案。 |
实际肽图中应检查什么
先明确酶切规则，再按序列分别统计漏切形式，而不只看总数。对关键肽段，比较完全切割形式与较长漏切形式的提取离子色谱图，并纳入不同修饰状态。检查与功能或质量有关的序列区域是否仍被覆盖；整体指标改善可能掩盖局部缺口。将酶解时间、温度、pH、还原步骤、酶活性和终止反应的时间作为一套关联流程审查。若方法用于长期趋势监测，应针对相关肽段形式设定验收标准，并验证跨天、跨分析人员的重复性。
同一篇论文还分别测试了C4和C18反相色谱柱分析疏水肽的表现。在一次USP mAb3比较中，肽段H44–65在下一次空白进样中的残留，在Accucore C4柱上为0.21%，在Accucore C18柱上为12.06%。这个结果说明，肽图分析的难点可能同时来自酶解和色谱分离。它不代表所有C4柱都优于C18柱：论文中的Hypersil柱比较结果有所不同，仍需检查序列覆盖率。[1，表1]
另一项独立的 NISTmAb 肽图优化研究比较了不同胰蛋白酶来源，并同时评估漏切、非特异性切割、酶自溶和已鉴定肽段总强度。在该实验中，重组猪源胰蛋白酶方案的漏切比例比另外两个酶来源 低三个百分点 ，但综合各项指标后，作者没有认定单一方案全面胜出。因此，不应仅凭一个总体百分比选择酶解条件。[2，图 6]
肽图比较至少应保存的记录
比较不同酶解流程时，应使用相同的起始材料和LC-MS进样顺序。按肽段分别记录酶切形式分布，同时保存总序列覆盖率、关键区域覆盖情况、修饰比例、酶自溶或背景峰，以及空白进样残留。即使无漏切肽段的占比提高，只要必需区域失去覆盖，新流程就还不能直接采用。
证据边界与下一步
这些结果来自 抗体经胰蛋白酶酶解后的肽图，不是未酶解的目录多肽，也不是 NHD 批次检测。可借鉴研究设计本地比较，再参照 LC-MS肽分析指南 ，并记录肽图的序列覆盖率及修饰鉴定结果。仅凭清晰的色谱峰和峰数，不能完整证明结构。
原始资料与主张溯源
- Kristensen DB, et al. 优化多属性分析流程：改善漏切、疏水肽色谱拖尾与残留. Analytical Chemistry. 2022;94:17195–17204. DOI 10.1021/acs.analchem.2c03820, PMID 36346901。 地点： 资料位置：实验部分“两步SMART酶解优化方案”（时间与温度）；结果部分同名章节、图3–4及表S5（60%、32%、34%及序列覆盖率限制）；表1（C4/C18柱的H44–65肽段残留）。已检查原始全文。
- Mouchahoir T, Schiel JE. 建立NISTmAb的LC-MS/MS肽图分析流程. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 2018. 地点： Results、图 6 及其讨论（酶来源比较与三个百分点的漏切差异）。独立的原始方法研究，数据不与 [1] 合并。
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原始记录与权威资料
- Kristensen DB 等。优化的多属性方法工作流程，解决疏水性肽段的漏切及色谱拖尾/残留问题。Analytical Chemistry。2022;94:17195–17204。来源 1。实验部分 → “优化的两步 SMART 消化方案”（时间/温度）；结果 → “优化的两步 SMART 消化方案”，图 3–4 和表 S5（60/32/34% 及覆盖度注意事项）；表 1（C4/C18 H44
- Mouchahoir T, Schiel JE. 针对 NISTmAb 开发一种液相色谱-质谱/质谱（LC-MS/MS）肽图谱分析方案。《分析与生物分析化学》。2018 年。位置：结果部分，图 6 及其讨论（胰蛋白酶来源的比较以及……）来源 2. 结果、图 6 及其讨论（胰蛋白酶来源比较及 3 个百分点未切割差异）。独立的基础方法研究；未与 [1] 合并分析。.
