分析手法 · 実践ガイド
ペプチドクロマトグラムの読み方：「95%純度」を理解する“
ペプチドのHPLCレポートを理解するには、まず軸、ピーク高さ、ピーク面積から始めましょう。
ペプチド試験報告書を開くと、山脈のように見える曲線の横に「95%純度」と印刷されていることがあります。この数字はどこから来るのでしょうか？一番高いピークが必ずしも注文したペプチドなのでしょうか？
このガイドを理解するのに化学の背景は必要ありません。1つの例のトレースを読み、その面積純度を計算し、報告書が答えるべき質問を特定します。
1。クロマトグラムは何を記録するのか？
HPLCは高速液体クロマトグラフィーを意味します。混合物中の成分を分離し、それらが装置を通過する際に検出する方法と考えてください。
異なる成分はカラムを異なる速度で移動することがあります。それらが検出器に到達すると、ソフトウェアがその信号を時間とともにプロットします。そのプロットがクロマトグラムです。その Watersの初心者向けガイド 分離と、その結果生じるピークとの関係について説明します。
まず図 1 の軸と4つのピークから見ていきましょう。まだすべての数値を理解する必要はありません。
- 横軸：時間。 ここで、minは分を意味します。この試験条件では、Bは 6.2 分で最大シグナルに達します。これがBの保持時間です。
- 縦軸：検出器応答。 これはシグナルの強さを示すもので、バイアル中のミリグラム数を直接示すものではありません。実際のUVレポートではmAUが使われることがあります。実際のレポートに記載された単位を確認してください。
- ベースライン：ピークの下にある基準線。 ソフトウェアが各ピークの面積を計算するには、開始点、終了点、ベースラインが必要です。
最初の確認： 検出器チャンネルと単位を確認してください。異なる検出器や波長のピーク高さを直接比較しないでください。
2。面積純度は高さではなく面積に依存します
ピークを山にたとえてみましょう。山頂は高さを表し、ベースラインより上の空間は面積を表します。細いピークは、面積が大きくなくても高く見えることがあります。
HPLC の面積純度は、通常、対象ピークの面積を計算に含まれる総面積と比較します。 Bachemのペプチド品質管理ガイド このアプローチと、210～220 nm付近のUV評価について説明しています。ご自身のレポートで使用されている波長と方法を確認してください。
図1の積分表にこれらの結果が含まれているとします。4つのピークがすべて含まれており、この例ではレスポンスファクター補正は適用されていません。
| ピーク | 保持時間 | 積分面積（任意単位） | 面積割合 |
|---|---|---|---|
| A | 3.1分 | 25 | 2.5% |
| B：ターゲット | 6.2 分 | 950 | 95.0% |
| C | 8.4 分 | 15 | 1.5% |
| D | 10.1 分 | 10 | 1.0% |
| 合計 | — | 1,000 | 100% |
まず、含まれている面積を合計します：25 + 950 + 15 + 10 = 1,000。次に、目標面積をその合計で割ります：
950 ÷ 1,000 × 100% = 95.0%
この結果は、次のことを意味します： ターゲットは、含まれるピーク面積の95.0%を占めています。 実際のレポートを確認するときは、その積分表と計算ルールを使用してください。
答えを表示
980 ÷ (980 + 12 + 8) × 100% = 98.0%。
3。ピークの位置はその同一性を証明するものではありません
図1では、Bがターゲットであるとすでに仮定しています。Bが最大のピークだからというだけで、その仮定をしてはいけません。
保持時間はメソッドによって異なります。カラム、移動相、またはグラジエントが変わると、成分が別の時間に現れることがあります。異なる成分でも保持時間が類似することがあります。
対象ピークがどのように同定されたかを尋ねてください。質問によっては、参照物質、質量測定、またはその他の適切な証拠が同定を支持することがあります。HPLC 分離と質量分析による証拠は異なる問いに答えるものであり、どちらも他方の万能な代替として扱うべきではありません。
4。尋ねる価値のある3つのパターン
- 互いに分離したピーク： これらの面積は一般に個別に積分しやすいです。小さいピークの正体は、その位置だけから推測することはできません。
- メインピークの横の小さなショルダー： これは不完全な分離を示唆する可能性がありますが、他の要因も寄与し得ます。それが対象面積の計算に影響するかどうかを尋ねてください。
- ブランク中の類似ピーク： 溶媒やシステムの寄与（キャリーオーバーの可能性を含む）を調べてください。ペプチド不純物と自動的に決めつけたり、説明なしに除去したりしないでください。
ピークの長いテーリングも議論する価値がありますが、それだけで製品が分解した証拠にはなりません。試験条件、注入、サンプルのいずれもピーク形状に影響し得ます。
見落とされやすいもう一つの限界： 2つの成分が同じ見かけのピークに寄与している可能性があります。 ピークが1つ見えることは、成分が1つだけ存在する証拠にはなりません。
5。小さなピークを1つ除外すると割合が変わります
積分とは、ベースラインとピーク境界を設定し、面積を計算するソフトウェアの処理です。どのシグナルを含めるかが結果に影響します。 Agilentの統合ガイダンス ピーク幅、しきい値、処理方法などの設定がなぜ分析手順に従う必要があり、レビューされなければならないかを説明しています。
私たちの例に戻りましょう。面積 25 のAが除外された場合、合計は 1,000 ではなく 975 になります：
950 ÷ 975 × 100% ≈ 97.44%
試料は変わっていませんが、計算結果は 95.0% ではなく約 97.44% となります。除外が常に誤りとは限りません。方法に基づいて正当に除外できるシグナルもあります。重要な問いは、 何が除外され、なぜ除外されたのか？ 印刷された結果を良く見せるためだけにピークを除去すべきではありません。
6。「95% 面積純度」は、粉末 10 mg 中の標的ペプチド 9.5 mg を意味するものではありません。
面積純度は、特定の方法で検出され対象に含まれるシグナルを比較するものです。粉末の重量には、水、カウンターイオン、その他の成分が含まれる場合もあります。
したがって、10 mg 表示と 95% HPLC 面積純度結果だけでは、バイアルに目標ペプチドの 9.5 mg が含まれていることを確立できません。実験で定義されたペプチド量が必要な場合は、適切な含量測定とその報告基準について確認してください。 Bachemのガイド は純度とペプチド含量を区別しています。
HPLC の面積純度は、エンドトキシン、無菌性、その他の専用測定に代わるものでもありません。1つのパーセンテージですべての品質上の疑問に答えられるわけではありません。
報告書を読むための実践的な順序
- サンプルを確認してください： 名前、仕様、ロット番号は、確認している材料と一致していますか？
- 方法を確認してください： 検出器チャンネル、波長、カラム、またはメソッドの参照が記載されていますか？
- ターゲットを特定してください： ピークは同定されていますか？また、その同定を裏付けるものは何ですか？
- 面積テーブルを確認してください： ターゲット面積と合計面積は、報告されたパーセンテージを再現していますか？
- 説明されていない特徴を確認してください： 明確化が必要なショルダー、小さなピーク、除外はありますか？
トレースが「良く見える」かどうかを判断するのではなく、具体的な質問ができるようになりました。ロット番号の不一致、未割り当てのターゲットピーク、欠落した面積表、不明確な計算基準などです。
ペプチド材料について問い合わせる際にこれらの質問を使用してください
検討している場合 GHK-Cu または LL-37、まず正確な製品と仕様を特定してください。次に、対応するロットで利用可能な記録を尋ねてください。カタログの説明はバッチレポートの代わりにはなりません。
すべての専門用語を知らなくても、このリクエストを使用できます：
製品と文書要件についてNHDに尋ねる、または読む ペプチド含量と純度の違い.