KPV تنها سه اسید آمینه دارد. استفاده مستقیم از روش کروماتوگرافی یک پپتید بلند ممکن است جداسازی به اندازه کافی واضح به دست ندهد. در مواجهه با سیگنالی نزدیک به جلوی پیک، ابتدا وضعیت نگهداشت را بررسی کنید، سپس درباره معنی‌دار بودن سطح پیک صحبت کنید.
کوتاه بودن به معنای آسان‌تر بودن تشخیص نیست
KPV یک تری‌پپتید متشکل از لیزین، پرولین و والین است. رفتار کروماتوگرافی نه تنها به طول، بلکه به بار، قطبیت، شکل انتهای زنجیره، فاز ثابت و فاز متحرک بستگی دارد. ظاهر شدن زودهنگام در یک روش ممکن است نشان‌دهنده نگهداشت ناکافی باشد، اما نمی‌توان تنها بر اساس «سه اسید آمینه» یک زمان نگهداشت مشخص را پیش‌بینی کرد. این مقاله درباره رویکرد ارزیابی روش بحث می‌کند و شرایط تشخیصی اختصاصی و تأیید نشده برای KPV ارائه نمی‌دهد.
ابتدا زمان مرده را پیدا کنید، سپس پیک هدف را ببینید
زمان مرده را می‌توان تقریباً به عنوان زمان عبور ماده‌ای که توسط ستون کروماتوگرافی نگهداشته نمی‌شود از سیستم در نظر گرفت و باید در سیستم و شرایط مربوطه اندازه‌گیری شود. فرض کنید در یک مثال آموزشی زمان مرده 1.0 min و پیک هدف 1.1 min باشد؛ ضریب نگهداشت k تقریباً برابر است با (1.1−1.0)÷1.0=0.1. این سیگنال بسیار نزدیک به ناحیه بدون نگهداشت است و باید تأثیرات شاهد، حلال و هم‌شویش را به دقت بررسی کرد؛ این داده واقعی اندازه‌گیری KPV نیست. [1]
مثال آموزشی: فاصله پیک هدف از جلوی پیک
- زمان مرده t₀: 1.0 min (فرضی)
- زمان نگهداشت پیک هدف tᵣ: 1.1 min (فرضی)
- ضریب نگهداشت k: (tᵣ − t₀) ÷ t₀ = 0.1؛ نیاز به ارزیابی مناسب بودن جداسازی
نمودار شاهد و نمودار نمونه را با هم مقایسه کنید
ابتدا فاز متحرک، حلال نمونه و در صورت لزوم شاهد ماتریس را مقایسه کنید، سپس ماده مرجع و نمونه را بررسی کنید. اگر پیک نمونه به طور غیرعادی با شاهد همپوشانی داشته باشد، نباید مستقیماً تمام سطح را به پپتید هدف نسبت داد. تطابق زمان نگهداشت به تنهایی نیز برای تأیید هویت کافی نیست؛ باید با ماده مرجع مناسب یا اطلاعات تشخیصی دیگر ترکیب شود. شاهد برای حذف پیک‌های ناخوشایند نیست، بلکه برای کمک به تفسیر منشأ سیگنال است.
تغییر روش جداسازی به معنای ایجاد مجدد روش است
حالت‌های کروماتوگرافی فاز معکوس، HILIC و غیره از برهم‌کنش‌های متفاوتی استفاده می‌کنند. منابع فنی Waters و Thermo Fisher نشان می‌دهند که ترکیبات قطبی نیاز به نگهداشت و گزینش‌پذیری مناسب دارند. پس از تغییر ستون یا فاز متحرک، ممکن است قضاوت هویت، یکپارچه‌سازی و قوانین کمی‌سازی قبلی دیگر قابل اعمال نباشند. انتخاب مسیر باید بر اساس نمونه واقعی و نتایج توسعه روش تعیین شود و نباید به صورت «همه پپتیدهای کوتاه باید از یک نوع ستون خاص استفاده کنند» نوشته شود. [2]
در اعتبارسنجی، فقط به ظاهر شدن پیک اصلی توجه نکنید
همچنین باید ارزیابی شود که آیا نمونه و اجزای مرتبط از هم جدا می‌شوند، آیا غلظت‌های پایین قابل اعتماد هستند، آیا تزریق مکرر و آماده‌سازی نمونه سازگار هستند، و آیا بازیابی کمی نیازهای کاربرد را برآورده می‌کند. اگر فقط تأیید اولیه هویت ماده مورد نظر است، شواهد لازم با وظیفه گزارش میزان ناخالصی متفاوت است. بالا بودن پیک هدف و منظم بودن شکل آن به تنهایی ثابت نمی‌کند که روش می‌تواند همه ناخالصی‌های مرتبط را تشخیص دهد. ابتدا تصمیمی که گزارش باید از آن پشتیبانی کند را مشخص کنید، سپس کارهای اعتبارسنجی را ترتیب دهید. [3]
سؤال را در فرم ارسال نمونه بنویسید
می‌توان پرسید: «آیا KPV در روش مورد استفاده نگهداشت کافی دارد؟ آیا می‌توانید شاهد، کروماتوگرام کامل و اطلاعات پشتیبان هویت را ارائه دهید؟ خلوص گزارش شده با چه معیاری محاسبه می‌شود؟» در اطلاعات خرید نیز باید توالی واقعی، فرم، شماره دسته و مشخصات حفظ شود. اگر آزمایشگاه ماده مربوطه را اعتبارسنجی نکرده است، ابتدا باید دامنه توسعه و مقدار نمونه مورد نیاز را تأیید کند؛ نام اختصاری در صفحه محصول نمی‌تواند جایگزین روش آزمون شود.
المصادر الأصلية
- Waters · column void volume
- Thermo Fisher · HILIC retention mechanisms
- FDA · ICH Q2(R2) validation of analytical procedures
تحقق من ظروف الدراسة وسجلات المادة كلٌّ على حدة. الحسابات التعليمية ليست نتائج اختبار دفعة.
KPV
