ANALYTISCHE METHODEN · PRAXISLEITFADEN
Serielle Peptidverdünnung: Jedes Röhrchen und jede Plattenposition nachvollziehen
Folgen Sie einer Verdünnungsreihe Röhrchen für Röhrchen, einschließlich des Volumens, das nach jedem Transfer verbleibt.
Eine Reihe von Röhrchen mit der Beschriftung 100, 50 und 25 µM sieht einfach aus. Die Schwierigkeit besteht darin, sich zu merken, welche Lösung wohin gelangt und wie viel übrig bleibt. Wir verfolgen eine zweifache Verdünnungsreihe vom ersten Röhrchen bis zur Platte.
Warum gleiche Volumina die Konzentration halbieren
Beginne mit 100 µL bei 100 µM und gib 100 µL geeignetes Verdünnungsmittel hinzu. Das Endvolumen beträgt 200 µL. Wenn kein Material verloren geht, bleibt die Menge des Peptids gleich, während sich das Volumen verdoppelt, sodass die Konzentration 50 µM beträgt.
100 µM × 100 µL ÷ 200 µL = 50 µM
Folge den nächsten vier Röhrchen
Behalte genügend 100 µM-Lösung in Röhrchen 1. Gib 100 µL Verdünnungsmittel in jedes der Röhrchen 2–5. Übertrage 100 µL aus Röhrchen 1 in Röhrchen 2 und mische; übertrage dann 100 µL aus Röhrchen 2 in Röhrchen 3 und mische. Fahre in dieser Reihenfolge fort.
Die Konzentrationen sind 100, 50, 25, 12.5 und 6.25 µM. Mische vor der Entnahme des Aliquots für das nächste Röhrchen, damit die übertragene Flüssigkeit die neu verdünnte Lösung repräsentiert.
Zählen Sie die Flüssigkeit, die in jedem Röhrchen verbleibt
Röhrchen 2 enthält nach dem Mischen 200 µL, aber nur 100 µL, nachdem Sie die Hälfte in Röhrchen 3 überführt haben. Dasselbe gilt für die späteren Transferröhrchen. Das letzte Röhrchen bleibt bei 200 µL, wenn Sie kein Aliquot entnehmen.
Dieser Unterschied ist wichtig, wenn Sie planen, wie viele Wells jedes Röhrchen befüllen kann. Das verbleibende Volumen des ersten Röhrchens hängt auch davon ab, wie viel Ausgangsstammlösung Sie vorbereitet haben.
Eine Arbeitslösung kann im Well erneut verdünnt werden
Wenn eine 50 µM Arbeitslösung mit einem gleichen Volumen einer anderen Lösung ohne Peptid gemischt wird, beträgt die Endkonzentration 25 µM. Die Konzentration im Röhrchen ist nicht automatisch die Konzentration im Well.
Zeichnen Sie eine Plattenkarte, die Konzentration, Replikate und Kontrollwells zeigt. So bleibt die Verdünnungsberechnung mit dem tatsächlichen Layout verbunden.
Noch einen Schritt prüfen
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12.5 µM. Das Endvolumen beträgt 160 µL. Wenn du dann 80 µL entnimmst, ist die verbleibende Lösung weiterhin 12.5 µM, aber es verbleiben nur 80 µL.
Die Berechnung geht davon aus, dass das Peptid gelöst bleibt und nicht am Gefäß verloren geht. Wenn die Wiederfindung bei niedrigen Konzentrationen wichtig ist, untersuche das separat.
Verwendung eines Verdünnungsplans mit KPV oder LL-37
Wenn du KPV- oder LL-37-Verdünnungen planst, prüfe vor dem Start die Stammlösungskonzentration und das Lösungsmittel. Bewahre die Verdünnungstabelle zusammen mit Produktform und Chargendetails auf, damit eine spätere Charge unter denselben geplanten Bedingungen verglichen werden kann.
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