純溶媒中では強いペプチドの信号が、ペプチドの実際の質量は減っていなくても、血漿中では弱くなることがあります。同時に溶出するマトリックス成分がエレクトロスプレーの応答を変えるためです。そのため、純溶液だけで調製した検量用試料は、生体試料中の応答を正しく表さない場合があります。候補となる代替ペプチドを実際に使用するマトリックスで試し、信号の強さだけでなく、検証した分析性能に基づいて定量用ペプチドを選ぶ必要があります。
リツキシマブ分析で実測された例
ヒト血漿中のリツキシマブについて、LC–MS/HRMS法とLC–MS/MS法を比較した研究において、研究者らはタンパク質の調製および消化後に代用ペプチドを生成した。同研究の表7には、いくつかの候補ペプチドに関するマトリックス効果が報告されている。HRMS法については、, 6つの異なる血漿由来試料 に 50 µg/mLのリツキシマブ. イオン抑制には顕著な違いが見られた。FSGSの平均値は−67%（範囲：−54%～−78%）、 pQVQは平均−11%（報告された範囲は+15%～−35%）、pQIVLは平均−93%（範囲は−88%～−95%）であった。 著者らは、両方のMS法においてpQIVLのマトリックス効果が大きかったため、pQIVLを判定基準としてのみ使用した。[1, §2.3.3, 表7]
| HRMSの代替ペプチド | 報告された平均マトリックス効果 | 試験条件 |
|---|---|---|
| FSGS | −67% | 6つのヒト血漿由来試料；リツキシマブを50 µg/mL添加 |
| pQVQ | −11% | 同じ研究のHRMS条件 |
| pQIVL | −93% | 同じ研究のHRMS条件。定性的確認に使用 |
使用されたLC–MS/MSシステム 4つの血漿由来試料, で急上昇し、 15 および 300 µg/mL. 同表7によると、pQVQの平均抑制値は−17%、pQIVLのそれは−22%と報告されている。これらの数値をHRMSの値と混同して、単一の「ペプチドマトリックス効果」として扱ってはならない。測定機器、ソースカウント、スパイク濃度が異なるためである。[1]
実務的な評価の組み立て方
タンパク質の配列が許す場合は、複数の候補ペプチドを選択してください。各候補の同一性と分離を確認した後、原液、抽出後のマトリックス、および完全に処理されたマトリックスにおける応答を比較してください。原液と抽出後の応答の対比は、イオン化の影響を特定するのに役立ちます。また、抽出後の応答と処理後の応答の対比からは、調製過程での損失が明らかになる場合があります。 複数の独立したマトリックスロットと、アッセイで測定する必要がある濃度範囲を確認してください。適切な同位体標識標準物質が利用可能な場合は、内部標準で正規化されたマトリックス係数を追跡してください。本論文では、フルレングスの標識リツキシマブを内部標準として使用しました。これは、消化後にのみ添加されるペプチドよりも多くの調製工程を経ることができます。 標準物質の添加タイミングは、アッセイが補正すると主張している内容と一致していなければならない。.
マトリックス効果は 分析対象と方法に固有. 抑制が比較的少ないペプチドであっても、許容可能な選択性、校正、精度、および消化挙動が依然として求められる。報告されているpQIVLの例のように、同定確認において信頼性を維持できるのであれば、抑制度の高い候補も定性指標として機能する場合があるが、それだけでは妥当な唯一の定量指標とはならない。 同論文において、著者らは検証済みの2つの手法に関する校正および精度の結果を報告しているが、これらは他の抗体や機器への転用可能性を証明するものではない。[1, §§2.3.2–2.3.3]
代替ペプチドの選択記録
候補ごとに次を記録します。（a）配列の固有性と裏づけとなるフラグメントイオン、（b）消化収率と未切断の形、（c）低濃度・高濃度における独立したマトリックスロット間のマトリックス因子の分布、（d）妨害成分との保持時間上の分離、（e）内標準で正規化した後の性能です。採用しなかった候補とその理由も残します。純溶媒中で見かけ上高い応答が得られても、これらの確認の代わりにはなりません。
その ICH M10ガイドライン は、マトリックス成分による分析対象の応答変化をマトリックス効果と定義しています。規制用途の生物分析法バリデーションでは、低・高のQC濃度について 少なくとも6つ マトリックスの供給源／ロット数であり、希少なマトリックスに対しては適切な柔軟性が確保されている。これは重要な設計上の基準であり、すべての探索的研究アッセイに自動的に適用される要件ではない。本論文のHRMS実験では6種類の血漿が使用された一方、MS/MS実験では4種類が使用された。[2、§§1.3および3.2.3]
解釈の範囲と次の手順
測定値は ヒト血漿中のリツキシマブ由来の代替ペプチド, 、遊離ペプチド標準物質やNHD製品ではありません。これらは、ある配列の分析応答を別の配列から推測できない理由を示しています。特定のペプチドの正確な質量や断片化を解釈するには、 LC–MSによる同定ガイドを参照してください。 面積純度と含量のガイドは、クロマトグラムの面積と含量の意味の違いを扱います。どちらもマトリックスに合わせたバリデーションの代わりにはなりません。
一次資料と記述の根拠
- Development, Validation, and Comparison of Two Mass Spectrometry Methods (LC-MS/HRMS and LC-MS/MS) for the Quantification of Rituximab in Human Plasma. 分子. 2021;26:1383. DOI 10.3390/molecules26051383, PMID 33806585。 所在地： §2.3.3 および表 7（血漿中の検出数、スパイク濃度、ペプチド特異的なマトリックス効果、および pQIVL 判定基準）；§2.3.2（校正の背景）；「方法」（全長安定同位体リツキシマブ）。表の値については、元の全文 XML ファイルで確認を行った。.
- International Council for Harmonisation. ICH M10: Bioanalytical Method Validation and Study Sample Analysis、最終ガイドライン、2022年。 所在地： §§1.3 および 3.2.3；規制の適用範囲および独立マトリックス・ロット設計。これは権威ある方法に関するガイダンスであり、本研究で測定された抑制値を示すものではない。.
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一次記録と権威ある出典
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