アスパラギンの脱アミド化はアスパラギン酸型またはイソアスパラギン酸型を生じることがあり、ペプチドマップの解釈を複雑にします。タンパク質分解後に修飾ピークが現れると、それを出発物質に帰属したくなります。しかし、調製物自体の寄与を測定していない限り、その帰属は安全ではありません。消化のpH、時間、ペプチド配列が結果に影響することがあります。
制御された pH の比較
Liuらは、酢酸アンモニウム中 pH 4.5 でのエンドプロテアーゼGlu-C消化を、重炭酸アンモニウム中 pH 8.0。彼らの研究には、タンパク質の例に加えてエキセナチドとACTH由来ペプチドが含まれていました。LC–MSで調べたエキセナチドのGlu-C断片では、その後 48時間 後、測定されたアスパラギニル ペプチドが脱アミド化物質に完全に変換されたことが論文で報告されています。 pH 4.5 では、同じ長時間のインキュベーション後に 約 1% の脱アミド化 が報告されます。同位体標識実験は、サンプル調製中の生成を裏付けました。 [1、結果、図 4]
| 研究中のエクセナチド Glu-C フラグメント | 48時間後の観察 | 境界 |
|---|---|---|
| pH 8.0 消化 | アスパラギニルペプチドは観察されませんでした。完全な脱アミド化が報告されている | すべてのペプチドの速度ではなく、このペプチドの極端に長時間の条件。 |
| pH 4.5 消化 | 測定された脱アミド化は約1% | 同じ研究の弱酸性条件。方法に依存します。 |
これらのデータは、すべてのペプチドを pH 4.5 で消化すべきだと ではない 。プロテアーゼ活性、切断特異性、完全性、緩衝液適合性、および配列範囲を、目的のアッセイに対して確立する必要があります。著者らは、弱酸性条件下で有用な Glu-C 活性を観察しましたが、無関係な酵素は同様に機能しない可能性があります。 48時間の長時間試験は、アーティファクトの可能性について有益です。これは推奨される日常的な培養時間ではありません。 [1]
消化前に修飾が存在したかどうかをテストする方法
同じ出発原料からの短い消化時間と長い消化時間の経過を分析します。可能であれば、異なる pH または切断ルートを使用したメソッドを比較し、サンプルを迅速に処理したときに同じ修飾画分が存在するかどうかを確認します。修飾の起源が品質決定の中心となる場合は、適切な標準または同位体追跡対照を使用してください。提案された割り当てをサポートするために、未修飾体、Asp体、isoAsp体を十分に分離します。単一の質量シフトだけでは構造異性体を区別できない場合があります。
修飾画分の隣に消化条件を報告してください。「1%の脱アミド化」のような結果は、ペプチド配列、消化時間、pH、定量方法がなければ別のアッセイに移すことはできません。製品品質については、 LC–MSによる同定ガイド でペプチドの同一性確認には一致する質量だけでなく追加の根拠が必要な理由が説明され、 保管安定性の証拠に関する解説 で劣化率に定義された安定性設計が必要な理由が説明されています。
独立した同位体標識研究では、 ¹⁸Oを含む水 を使用して、サンプル処理中に生成された脱アミドとその処理前にすでに存在していた脱アミドを区別しました。その具体的な質量シフト ロジックは、標識化学と断片化方法に依存します。これは確認オプションであり、時間経過制御のショートカットではありません。 [2]
脱アミド化の結果を報告する際に必要な情報
- 正確な Asn 含有配列、消化酵素、pH、温度、持続時間、および反応停止時点。
- サポートされている場合にのみ Asp/isoAsp 割り当てを使用して、ターゲットの変更されたフォームと未変更のフォームが分離されているか、正しくデコンボリューションされているという証拠。
- 同じ出発材料からの短い準備と長い準備の対照。処理中にフラクションが上昇した場合は、アッセイアーチファクトの可能性があるとしてラベルを付けます。
- 定量値の分母: 修正されたピーク面積、同位体正規化応答、またはモル分率は、検証なしでは互換性がありません。
エビデンスの適用範囲
これは 方法実験であり、NHD ペプチドの安定性、純度、または出荷判定の状態を証明するものではありません。その実際的な貢献は、消化後に観察された修飾が元の試料にも存在したという仮定に異議を唱える制御された方法です。
一次資料と記述の根拠
- リュー・Sら Mildly Acidic Conditions Eliminate Deamidation Artifact during Proteolysis: Digestion with Endoprotease Glu-C at pH 4.5. アミノ酸。2016;48:1059–1067。DOI 10.1007/s00726-015-2166-z、PMID 26748652。 所在地： 要約 (方法)、材料と方法 (エクセナチド/ACTH、緩衝液および酵素)、結果および図 4 (48 時間 pH 8.0 対 4.5 観察)、論文で引用されている補足図 S3 (同位体証拠)。一次全文チェック済み。
- タンパク質およびペプチド試料調製中の脱アミド化をモニターするための¹⁸O標識の使用. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. DOI 10.1016/j.jasms.2008.02.011、PMID 18394920。 場所： 既存の脱アミド化と処理に起因する脱アミド化を¹⁸O標識で区別することに関する要旨および方法・結果。独立した一次分析研究であり、エキセナチドの比較に数値的な速度は移されていません。
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一次記録と権威ある出典
- Liu S, et al. 穏やかな酸性条件によりタンパク質分解中の脱アミド化アーティファクトが排除される：pH 4.5 でのエンドプロテアーゼGlu-Cによる消化。Amino Acids。2016;48:1059–1067。出典 1. 抄録（方法）、材料および方法（エクセナチド／ACTH、緩衝液および酵素）、結果および図 4（pH 8.0 と 4.5 における 48 時間の観察結果）、論文で引用されている補足図 S3（同位体による証拠）。原著の全文
- タンパク質およびペプチド試料調製中の脱アミド化をモニターするための¹⁸O標識の使用出典 2。既存の脱アミド化と処理誘発性脱アミド化を区別する¹⁸O標識に関する抄録および方法/結果。独立した一次分析研究。エキセナチド比較に数値的な速度は移行していない。
