MÉTHODES ANALYTIQUES · GUIDE PRATIQUE
Un pic HPLC peut cacher deux composants : apprenez à lire la séparation
Découvrez pourquoi la forme du pic est importante avant de lire un pourcentage de pureté.
Un chromatogramme présente un grand pic. Cela signifie-t-il que l'échantillon ne contient qu'un seul composant ? Pas nécessairement. Deux composants qui arrivent proches l'un de l'autre peuvent produire un signal qui ressemble à un seul pic. Voici comment cela se produit.
D'abord, que montre un pic ?
Dans HPLC, un échantillon traverse une colonne. Différents composants peuvent la traverser à des vitesses différentes. Le détecteur enregistre leurs signaux à leur sortie : le temps est porté sur l'axe horizontal, et l'intensité du signal sur l'axe vertical.
Lorsque deux composants sortent presque en même temps, le détecteur peut enregistrer une forme combinée plutôt que deux pics clairement séparés.
Pourquoi une meilleure séparation change la donne
Imaginez deux groupes qui franchissent une porte. S'ils arrivent en même temps, vous pouvez les compter comme une seule foule. S'ils arrivent à des moments différents, les groupes sont plus faciles à distinguer. La séparation dans la colonne remplit un rôle similaire.
Dans le second graphique pédagogique, les deux pics sont plus éloignés. Cela rend chacun plus facile à examiner et à mesurer. Ce sont des courbes simulées, et non un test avant-après d'un lot NHD.
Utilisez un nombre pour décrire l'écart entre les pics
La résolution, notée Rs, compare l'écart entre les temps de deux pics avec leurs largeurs. Pour cet exemple, utilisez les largeurs mesurées à la ligne de base : Rs = 2 × (deuxième temps − premier temps) ÷ (première largeur + deuxième largeur).
Les pics apparaissent à 5.0 et 5.6 minutes, avec des largeurs à la ligne de base de 0.4 minutes chacune. Rs = 2 × 0.6 ÷ 0.8 = 1.5. Un écart plus grand ou des pics plus étroits donnent une valeur plus élevée.
Ne mélangez pas les largeurs à la ligne de base avec les largeurs à mi-hauteur ; elles utilisent des formules différentes. De plus, 1.5 est la réponse de cet exemple, pas une règle d'acceptation pour toutes les méthodes.
Pourquoi cela compte pour la pureté
Un calcul de pureté basé sur l'aire dépend des signaux que la méthode sépare, détecte et compte. Si un autre composant se cache sous le pic cible, son signal peut être inclus dans cette aire.
Lisez donc tout le chromatogramme et la méthode, pas seulement le pourcentage. La forme du pic seule ne peut pas non plus vous indiquer l'identité de chaque composant.
Essayez une paire de pics plus rapprochés
Gardez les deux largeurs de ligne de base à 0.4 minutes, mais déplacez le second pic à 5.2 minutes. L'écart n'est plus que de 0.2 minutes.
Voir la réponse
2 × 0.2 ÷ 0.8 = 0.5. La valeur plus petite reflète un écart plus petit par rapport à la largeur du pic.
Lecture des informations d'analyse GHK-Cu ou KPV
Pour GHK-Cu ou KPV, demandez quels enregistrements d'analyse sont disponibles et comment le signal cible a été identifié. Si un chiffre de pureté est fourni, lisez-le avec sa méthode et le tracé complet.
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BPC-157
GHK-Cu