Suponha que o sinal mais forte em um ensaio de peptídeo apareça ao longo da borda da placa. Antes de decidir que o peptídeo causou a mudança, verifique onde os tratamentos e controles foram colocados. Um padrão que segue a posição na placa merece uma investigação diferente de um padrão que segue o tratamento.
A placa faz parte da medição
Um estudo de ensaio imunoenzimático com 1980 examinou a adsorção de proteínas em placas de microtitulação. Ele relatou coeficientes de variação de adsorção de 5.2–29.5% e maior adsorção nos poços das bordas. Em um ensaio sanduíche, a variação relatada para uma amostra individual foi de ±18%. Esses achados referiram-se aos imunoensaios e sistemas de placas testados, não ao material LL-37, MOTS-c ou NHD. Eles mostram por que um poço não deve ser presumido como intercambiável com qualquer outro poço. Leia o estudo original, PMID 6154544.
Quantos poços estão na borda?
Considere uma placa retangular de 96 poços com 8 linhas e 12 colunas. Sua borda externa contém 2 × 12 + 2 × (8 − 2) = 36 poços. O interior contém 6 × 10 = 60 poços. Assim, 36 ÷ 96 = 37.5% dos poços ficam na borda.
| Região | Poços | Significado |
|---|---|---|
| Borda externa | 36 | Posições a examinar para um padrão relacionado à localização |
| Interior | 60 | Um conjunto diferente de posições, não automaticamente um controle não afetado |
| Total | 96 | Apenas geometria; nenhum tamanho de efeito experimental está implícito |
Este é um cálculo geométrico. Isso não significa que 37.5% das medições estejam erradas, ou que todos os poços de borda devam ser descartados.
Mantenha o mapa da placa
Registre o tratamento, o controle, o identificador da amostra e a posição de cada poço. Se um tratamento ocupa apenas poços de borda e o controle ocupa apenas poços centrais, o delineamento tornou difícil separar tratamento e localização. Um resultado isolado não consegue resolver essa escolha.
Durante o desenvolvimento do método, compare condições de controle equivalentes nas posições que pretende usar. Um padrão de posição pode levar a verificações da superfície da placa, do manuseio e das condições ambientais. A verificação relevante depende do ensaio. Um ensaio de ligação proteica e um ensaio com células vivas não precisam ter a mesma causa de variação.
Decida as exclusões antes de ler o desfecho
Não remova um resultado de borda apenas porque ele discorda da conclusão desejada. Use os critérios de qualidade planejados do ensaio e documente o motivo de qualquer medição excluída. Se o experimento não consegue distinguir tratamento de posição, repeti-lo com um delineamento adequado pode ser mais informativo do que forçar uma afirmação forte a partir dos dados existentes.
Conecte o ensaio ao material
Ao comparar material de pesquisa LL-37 ou material de pesquisa MOTS-c, mantenha a identidade declarada, a forma fornecida, a base de quantidade e os registros de lote disponíveis junto com o mapa da placa. Um sinal alterado pode vir do material, do ensaio ou da interação entre eles; verificações de localização ajudam a evitar uma explicação prematura.
Pergunte sobre a variante de pesquisa selecionada e os registros que seu projeto exige. Achados de ensaios publicados não estabelecem as propriedades de um lote NHD. Materiais de catálogo são para pesquisa, desenvolvimento e fabricação, não para uso humano ou veterinário.
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